# 技术要点速查（章节写作用，全书统一事实来源）

> 所有章节的**技术参数、版本号、命令**以本文件为准，避免各章不一致。

## 1. 10x Visium 硬指标（写进 02/07/08 章）
- 捕获区 6.5×6.5 mm；约 5000 个 spot；spot 直径 ≈ 55 μm；spot 中心间距 100 μm
- 每个 spot 覆盖约 1–10 个细胞（随组织类型而异），本质是"多细胞混合信号"
- 新鲜冷冻（FF）样本用 poly-dT 捕获 poly-A mRNA；FFPE 样本用探针法（Visium FFPE，需先做探针杂交，另需去石蜡/抗原修复）
- 数据文件结构：`barcodes.tsv.gz`（spot 条形码）、`features.tsv.gz`（基因）、`matrix.mtx.gz`（计数）、`spatial/`（`tissue_positions_list.csv` 坐标、`scalefactors_json.json` 缩放因子、`tissue_hires_image.png`/`tissue_lowres_image.png` 组织图像）
- 测序读段含：空间条形码（16 bp）+ UMI（12 bp）+ poly-A 后序列

## 2. 软件版本（写进 06 章）
- R ≥ 4.3；Seurat v5（注意 `CreateSeuratObject(counts, assay = "Spatial")`、`SCTransform()`）；CellChat v2（`devtools::install_github("jinworks/CellChat")`）；BayesSpace（Bioconductor，`platform = "Visium"`）；tidyverse、patchwork、ComplexHeatmap
- Python ≥ 3.10；scanpy ≥ 1.10、squidpy ≥ 1.4、anndata、matplotlib、pandas/numpy；cell2location（scvi-tools 生态，可选）
- 环境管理：conda/mamba（`conda create -n spatial python=3.10`；R 用 `renv` 或 conda R 亦可）；Windows 装 R 包需 Rtools（Bioconductor 包必须）
- 内存提示：Visium 单切片 Seurat 约 2–6 GB；cell2location 训练建议 ≥ 16 GB

## 3. 核心分析命令速查（各章引用，不必展开全部）
**Seurat v5 预处理**（08 章）：
```r
library(Seurat)
obj <- Load10X_Spatial(data.dir = "data/visium/", filename = "filtered_feature_bc_matrix.h5")
obj[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(obj, pattern = "^MT-")
obj <- subset(obj, subset = nFeature_Spatial > 200 & nCount_Spatial > 500 & percent.mt < 25)
obj <- SCTransform(obj, assay = "Spatial", verbose = FALSE)
obj <- RunPCA(obj) %>% FindNeighbors(dims = 1:30) %>% FindClusters(resolution = 0.6) %>% RunUMAP(dims = 1:30)
SpatialDimPlot(obj, label = TRUE)
```
**marker 注释**（09 章）：
```r
markers <- FindAllMarkers(obj, only.pos = TRUE, min.pct = 0.25, logfc.threshold = 0.5)
```
**cell2location 去卷积**（09 章，Python）：
```python
import cell2location
# 参考单细胞：构建 reference 模型 → 训练 → 用 trained model 估计 spot 上的细胞丰度
# 输出：adata.obsm["q05_cell_abundance_w_sf"]（spot × 细胞类型 丰度）
```
**BayesSpace 空间聚类**（10 章，R）：
```r
library(BayesSpace); library(SingleCellExperiment)
sce <- spatialPreprocess(sce, platform = "Visium", n.PCs = 15)
sce <- spatialCluster(sce, q = 7, platform = "Visium", d = 15)
clusterPlot(sce)
```
**Squidpy 邻域富集**（10 章，Python）：
```python
import squidpy as sq
sq.gr.spatial_neighbors(adata, coord_type="generic", n_neighs=6)
sq.gr.nhood_enrichment(adata, cluster_key="celltype")
sq.pl.nhood_enrichment(adata, cluster_key="celltype")
```
**CellChat v2**（11–13 章，R）：
```r
library(CellChat)
cellchat <- createCellChat(object = obj, group.by = "celltype")
cellchat@DB <- CellChatDB.human
cellchat <- subsetData(cellchat)
cellchat <- identifyOverExpressedGenes(cellchat)
cellchat <- identifyOverExpressedInteractions(cellchat)
cellchat <- computeCommunProb(cellchat, type = "triMean")
cellchat <- filterCommunication(cellchat, min.cells = 10)
cellchat <- computeCommunProbPathway(cellchat)
cellchat <- aggregateNet(cellchat)
netVisual_circle(cellchat); netVisual_bubble(cellchat); rankNet(cellchat)
# 空间模式（v2）：createCellChat 时使用含空间坐标的对象即自动启用
# 条件/生态位比较：compareInteractions(cellchat, group.1, group.2)
```
**COMMOT 空间通讯**（13 章，Python，可选）：
```python
import commot as ct
ct.tl.spatial_communication(adata, database_name="CellChat", dis_thr=250,
                            heteromeric=True, pathway_sum=True)
```
**Misty**（04 章提方法、不实操）：`mistyR` R 包，多视图（自身/邻域/旁区）解释方差。

## 4. 生态位命名与特征（10 章）
| 生态位 | 典型组成 | 特征通路/marker |
| --- | --- | --- |
| 肿瘤核心 | 肿瘤细胞为主、血管内皮 | EPCAM/KRT、VEGF 高 |
| 侵袭前沿 | 肿瘤+CAF 交界、EMT 特征 | VIM/ZEB1/TGF-β 高 |
| 免疫浸润区 | T/B/巨噬细胞富集 | CD3D/CD8A/MS4A1 高 |
| 基质区 | CAF、ECM 富集 | COL1A1/DCN/PDGFRA 高 |
（名称仅为教学约定，真实课题应基于数据+先验命名并给出依据）

## 5. 通讯数据库与通路（11/13 章）
- CellChatDB.human：含分泌信号、ECM-受体、细胞-细胞接触（含共刺激/共抑制）三类；v2 扩展了更多物种与互作
- 教学示例通路：TGFb（TGFB1-TGFBR2）、PD-L1（CD274-PDCD1）、MIF（MIF-CD74）、GALECTIN（LGALS9-HAVCR2）、VEGF（VEGFA-KDR）、CXCL（CXCL12-CXCR4）、CCL（CCL5-CCR5）、IL10（IL10-IL10RA）、ECM（FN1-ITGA5、SPP1-CD44）
- 统计：CellChat 通讯概率用质量作用定律模型 + 排列检验（`computeCommunProb` 内置），跨条件比较用 `netVisual_diff`/`compareInteractions`
- **重要提醒**：通讯推断是计算预测，需空间共定位（Squidpy 邻域富集）、表达证据、必要时实验（抗体中和/敲除）验证；写进 11/13 章的"注意事项"

## 6. 公开数据源（07 章）
- 10x Genomics 官网 Datasets 页面：Visium 系列 demo（Human Breast Cancer、Human Lymph Node、Mouse Brain 等），下载"filtered feature-barcode matrix (H5)"与"spatial"目录
- spatialLIBD（Bioconductor，`spatialLIBD::fetch_data("visium_IFDLPFC")`）：人脑背外侧前额叶 DLPFC Visium 数据（Maynard et al. 2021）
- GEO 检索 "Visium"；细胞图谱类：Broad single cell portal、Zenodo
- 教学建议：**人乳腺癌 demo**（组织结构典型、生态位分明）作为主示例；结直肠癌/黑色素瘤作为拓展
- 数据下载后登记：样本 id、URL、md5、授权（10x demo 数据集为公开可用，注明来源即可）

## 7. 全书统一 marker 基因集（09 章）
肿瘤细胞 EPCAM/KRT8/KRT19；CAF COL1A1/COL3A1/DCN/PDGFRA；CD8 T CD3D/CD8A/GZMB；巨噬细胞 CD68/CD163/C1QA；B 细胞 MS4A1/CD79A；内皮细胞 PECAM1/VWF

## 8. 统计与严谨性要求
- 差异表达/通讯比较一律说明校正方法（默认 BH-FDR）
- 所有"模拟数据演示"图在正文图注注明
- 术语：spot 保留英文；空间生态位 spatial niche；通讯重编程 communication reprogramming
