# 第 05 章 课题设计：创新点拆解与实验路线

> 很多新手拿到空间转录组数据后的第一反应是“赶紧跑 CellChat”。本章请你先按住手：花半天想清楚课题的一句话、三个创新点、三条可证伪的假设。设计想清楚了，后面十章的代码都是执行，而不是摸索。

## 本章目标

学完本章，你应该能够：

1. 用一句话模板写出自己的课题；
2. 说清“生态位视角、通讯重编程、空间共定位证据”三个创新层次分别新在哪里；
3. 把课题拆成可证伪的研究假设（H1/H2/H3），并知道什么结果会推翻它们；
4. 对照路线图说清每一步用哪个方法、对应本书哪一章、产出什么；
5. 避开课题设计的四个常见误区。

## 5.1 一句话课题模板

本书的课题可以压缩成一句话：

> **比较肿瘤组织不同空间生态位的细胞通讯网络，揭示微环境“通讯重编程”（communication reprogramming）。**

这句话可以当模板拆开看，四个成分各对应一种设计决策：

- **比较对象**：“不同空间生态位”——肿瘤核心、侵袭前沿、免疫浸润区、基质区（空间生态位的定义见第 4 章）。这决定了分析的单元是“生态位”而不是“整张切片”。
- **分析内容**：“细胞通讯网络”——配体-受体互作、通路活性、网络结构（第 11 章）。
- **核心结论**：“揭示通讯重编程”——生态位之间通讯的系统性差异，即“生态位特异（niche-specific）的通讯程序”（第 13 章）。
- **研究背景**：“肿瘤微环境”——生物学语境，决定了结果要往免疫抑制、EMT、血管生成等肿瘤学故事上落（第 1 章）。

把模板里的词替换成你自己的系统（比如结直肠癌、黑色素瘤），就得到你的课题一句话。注意：好的课题一句话应该**同时包含比较对象、分析内容、预期结论**，缺一个都容易被评审追问“所以呢？”。

## 5.2 创新点拆解：三个层次

### 5.2.1 第一层：生态位视角替代全局平均视角

常规分析把整个组织当成一个“大样本”，在全局水平比较肿瘤与正常、或比较不同病人。本书把镜头拉近：**以空间生态位为分析单元**。全局分析会平均掉空间异质性——侵袭前沿的免疫抑制信号会被肿瘤核心稀释（第 4 章 4.6 节已论证）。生态位视角的贡献在于让“位置”参与生物学结论：同一个信号，在肿瘤核心和侵袭前沿的含义可能完全不同。对应章节：第 10 章（生态位识别）。

### 5.2.2 第二层：通讯“重编程”而非单点通讯

比“谁在和谁说话”更进一步的问题是“**生态位之间的通讯程序有什么系统性差异**”。通讯重编程（communication reprogramming）在本教程中的操作化定义是：**生态位间通讯网络在数量、强度、通路层面的系统性差异**（第 13 章）。单点通讯（如“TGF-β 在肿瘤里上调”）随处可做；而“侵袭前沿整体切换到免疫抑制 + 侵袭相关的通讯程序，肿瘤核心则保持生长信号为主的程序”是**系统级、可对比、可讲故事**的结论，这是第二个创新点。

### 5.2.3 第三层：空间共定位证据增强

通讯推断本质是计算预测（第 4 章提醒过）。本书用**三重证据**给结论加固：① 去卷积（deconvolution）确定每个 spot 的细胞组成（第 9 章）；② 邻域富集（nhood enrichment）证明“配体细胞与受体细胞在空间上真的相邻”（第 10 章）；③ 空间通讯（CellChat v2 空间模式 / COMMOT 空间活性）把通讯信号定位回组织位置（第 11、13 章）。三重证据互相独立、互相印证，是审稿人最喜欢的“验证意识”，也是新手最容易被问倒的地方。

## 5.3 研究假设：可证伪的才是假设

课题设计的关键一步是把“我想看看有什么差异”升级为“我认为存在什么差异”——后者才可证伪。本书登记三条核心假设（与研究清单保持一致）：

| 编号 | 假设 | 可证伪判据（什么结果会推翻它） | 对应章节/图 |
| --- | --- | --- | --- |
| H1 | 不同空间生态位的通讯网络存在系统性差异（数量/强度/通路） | 若各生态位通讯网络在数量、强度、通路三个维度都无显著差异（排列检验不显著） | 第 12–13 章，fig13/fig14 |
| H2 | 侵袭前沿生态位存在免疫抑制性通讯重编程（如 PD-L1/PD-1、TGF-β 高活性） | 若侵袭前沿的免疫检查点与免疫抑制通路活性不高于其他生态位 | 第 13 章，fig14/fig15 |
| H3 | 生态位分区通讯分析比全局分析揭示更多空间异质性信号 | 若全局分析能复现分区分析的全部显著互作、无新增信息 | 第 12 章，fig12/fig13 |

写假设时请注意三条纪律：① 假设里**不出现“可能”“或许”**；② 每一条都要写清“什么数据会让我认输”（上面第三列就是）；③ 假设个数 2–3 条为宜，贪多则验证成本失控。H2 里提到的 PD-L1（配体 CD274）/PD-1（受体 PDCD1）、TGF-β（TGFB1-TGFBR2）都是 CellChatDB.human 收录的教学示例通路（见 00-TECH 第 5 节），第 13 章会逐一检验。

## 5.4 分析路线图：从数据到论文

图 5-1 是全书路线图（fig01）的完整版。请把它贴在屏幕边上：每完成一章，就在图上划掉一段，你会很有成就感。

![图 5-1 全书技术路线图：基础铺垫（01–04）→ 课题设计（05）→ 环境与数据（06–07）→ 预处理与注释（08–09）→ 生态位识别（10）→ 分区通讯（11–12）→ 通讯重编程（13）→ 写作交付（14–15）。](figures/fig01_roadmap.png){width=90%}

把路线图落到“步骤 × 方法 × 章节 × 产出”的表格，就是你的执行清单：

| 步骤 | 方法/工具 | 本书章节 | 预期产出 |
| --- | --- | --- | --- |
| 环境搭建 | conda + R/Python 工具链 | 第 06 章 | 可复现环境（yml/lock） |
| 数据获取 | 10x 官网 / spatialLIBD | 第 07 章 | 原始数据 + 数据清单 |
| 预处理与质控 | Seurat v5 / scanpy | 第 08 章 | 质控图、过滤后的对象 |
| 细胞类型注释 | marker 打分 + cell2location 去卷积 | 第 09 章 | 每 spot 细胞组成、类型空间图 |
| 生态位识别 | BayesSpace + Squidpy nhood enrichment | 第 10 章 | 生态位空间图 + 共定位富集热图 |
| 生态位内通讯 | CellChat v2 分区模式 | 第 11–12 章 | 分生态位通讯网络与强度对比 |
| 通讯重编程 | compareInteractions + COMMOT 空间活性 | 第 13 章 | 差异通讯气泡图、通路热图、Sankey |
| 写作交付 | 图表规范 + 论文结构 | 第 14–15 章 | 论文级图表与结果叙述 |

把表格翻译成一段“流水线骨架”伪代码，贴在脚本最前面当目录用（不可直接运行，各步骤的可运行版本见对应章节）：

```r
# 伪代码：本书课题的分析流水线骨架（对应图 5-1 路线图，不可直接运行）
# 各步骤的可运行版本见对应章节；伪代码仅用于看清“每一步在做什么”

# ---- 第 06-07 章：环境与数据 ----
# conda activate spatial                  # 激活 Python 环境（第 6 章）
# source("code/02_download.R")            # 下载 Visium 数据（第 7 章）

# ---- 第 08 章：预处理与质控 ----
obj <- Load10X_Spatial(data.dir = "data/visium/",
                       filename = "filtered_feature_bc_matrix.h5")
obj <- subset(obj, subset = nFeature_Spatial > 200 &
               nCount_Spatial > 500 & percent.mt < 25)
obj <- SCTransform(obj, assay = "Spatial") |>
  RunPCA() |> FindNeighbors(dims = 1:30) |> FindClusters(resolution = 0.6)

# ---- 第 09 章：细胞类型注释（策略 A marker 打分 / 策略 B 去卷积）----
obj <- 注释细胞类型(obj, markers = c("EPCAM", "CD3D", "CD68", "COL1A1"))  # 伪代码

# ---- 第 10 章：生态位识别（BayesSpace 分区 + Squidpy 邻域富集验证）----
niche <- BayesSpace聚类(obj, q = 4)       # 伪代码：空间聚类划域
验证  <- nhood_enrichment(niche)          # 伪代码：共定位 z 分数验证组成

# ---- 第 11-12 章：生态位内通讯（CellChat v2 分区模式，逐生态位）----
net <- lapply(生态位列表, CellChat分析)   # 伪代码：每个生态位独立建 CellChat

# ---- 第 13 章：通讯重编程（差异比较 + COMMOT 空间活性）----
diff   <- compareInteractions(前沿, 核心) # 伪代码：生态位间差异比较
commot <- spatial_communication(坐标)     # 伪代码：COMMOT 空间活性图

# ---- 第 14-15 章：论文级图表与结果写作 ----
# 输出 fig10-fig16 并组织成论文 Figure 2 版式（第 14 章）
```

## 5.5 预期图表清单：先想好结果长什么样

课题设计阶段就把“最终要交出哪些图”列出来，能防止分析做到一半迷失方向。fig08–fig17 对应本书结果部分的 10 张核心图（均为模拟数据演示，真实分析长这样）：

| 图 | 一句话内容 | 出现章节 |
| --- | --- | --- |
| fig08_clustering | 降维散点 + 聚类映射回切片的空间分布 | 第 08 章 |
| fig09_celltype | 每 spot 主要细胞类型的空间图 + 各生态位组成堆叠条形图 | 第 09 章 |
| fig10_niche | 生态位识别最终结果：切片按四种生态位着色 | 第 10 章 |
| fig11_nhood | 邻域共现富集热图：细胞类型对 z 分数 | 第 10 章 |
| fig12_comm_network | 各生态位并列的通讯网络圆图（边粗=强度） | 第 11–12 章 |
| fig13_comm_barplot | 各生态位通讯数量与强度比较柱状图 | 第 12–13 章 |
| fig14_diff_comm | 生态位间差异通讯气泡图 + Δ 通讯概率热图 | 第 13 章 |
| fig15_pathway_heatmap | 生态位 × 信号通路活性热图 | 第 13 章 |
| fig16_reprogramming | 通讯重编程 Sankey 流量图（来源生态位→通路→靶细胞） | 第 13 章 |
| fig17_paper_figure | 论文 Figure 2 版式：生态位 + 富集 + 差异 + 通路四联 | 第 14–15 章 |

把这张表当成你的“图预算”：如果分析结束时某张图做不出来，说明对应的分析步骤还没走通；如果做出来但讲不出故事，说明设计阶段就没想清楚——现在补还来得及。

## 5.6 课题常见误区

- **误区一：贪多求全**。把 CellChat、NicheNet、CellPhoneDB、COMMOT、Giotto 全跑一遍，图做了一大堆，但每个都浅尝辄止。对策：围绕假设选工具（第 4 章决策树），一套主线（BayesSpace + CellChat v2 + COMMOT）走到底。
- **误区二：不设对照生态位**。只分析侵袭前沿，没有肿瘤核心或基质区做对照，“重编程”就无从谈起——重编程是**生态位间的差异**，没有对照就没有差异。对策：至少选一个“基线”生态位（通常肿瘤核心或基质区）做参照。
- **误区三：忽视空间验证**。表达层面看到 PD-L1/PD-1 上调就下结论，却没有邻域富集或空间共定位证据，审稿人一句“这跟单细胞分析有什么区别”就站不住。对策：把第 5.2.3 节的三重证据写进计划。
- **误区四：命名随意**。生态位名字（肿瘤核心、侵袭前沿……）必须由 marker 证据 + 组织学先验支撑，不能凭感觉贴标签（00-TECH 第 4 节也强调“名称仅为教学约定”）。

## 5.7 练习：写出你的课题

动手题（建议 30 分钟完成，写作顺序别反）：

```markdown
# 我的课题设计（模板）
## 课题一句话
比较＿＿＿＿＿（研究对象，如结直肠癌组织）不同＿＿＿＿＿（空间生态位）
的＿＿＿＿＿（细胞通讯网络/通路活性），揭示＿＿＿＿＿（通讯重编程/免疫抑制程序）。
## 假设 H1
＿＿＿＿＿生态位的＿＿＿＿＿（通讯强度/通路）显著高于/低于＿＿＿＿＿生态位。
（判据：若＿＿＿＿＿则不成立）
## 假设 H2
＿＿＿＿＿生态位存在＿＿＿＿＿（如免疫抑制性）通讯重编程，表现为＿＿＿＿＿
（如 PD-L1/PD-1、TGF-β 高活性）。
（判据：若＿＿＿＿＿则不成立）
```

## 本章小结

- 课题一句话模板 = 比较对象 + 分析内容 + 预期结论，四个成分缺一不可。
- 三个创新层次：生态位视角（分析单元）、通讯重编程（系统差异）、空间共定位证据（三重验证）。
- 三条可证伪假设 H1/H2/H3 各有明确的反证判据，对应第 12–13 章与 fig13–fig15。
- 路线图（fig01）把每一步对应到章节与产出，图预算（fig08–fig17）防止分析跑偏。
- 避开贪多求全、无对照生态位、缺空间验证、命名随意四个坑。

## 练习与思考

1. **动手题**：按 5.7 的模板完成“我的课题一句话 + 两个可证伪假设”，判据一栏必须写具体（什么统计结果算推翻）。
2. **判断题**：以下哪句是可证伪假设？（a）“肿瘤微环境很复杂”；（b）“侵袭前沿的免疫抑制通路活性显著高于肿瘤核心”；（c）“不同生态位可能有些差异”。
3. **分析题**：为什么说“不设对照生态位就无法谈重编程”？请用 fig12 的三张并列网络图说明。
4. **选择题**：你的分析想证明“配体细胞与受体细胞在空间上相邻”，应该用哪个方法的哪个输出？
5. **讨论题**：如果 H3 被推翻（全局分析能复现分区分析的全部信号），你的课题还成立吗？该怎么调整叙述？
