# 《肿瘤微环境空间生态位细胞通讯重编程分析》教程大纲

## 书籍信息
- **书名**：空间生态位与细胞通讯重编程——肿瘤微环境空间转录组分析实战教程
- **读者**：刚入门的生信新手（有基础 R/Python 更佳，无也可跟学）
- **目标**：从零完成一个"空间生态位 × 细胞通讯重编程"课题：数据获取 → 预处理 → 生态位识别 → 分区通讯分析 → 差异（重编程）分析 → 论文级图表
- **篇幅**：约 16 章正文 + 3 附录，每章 2500–4000 字，全书约 4 万字
- **配套**：17 张教学图（figures/）、10 个可运行 R 脚本（code/）、共享规范（tutorial/00-SPEC.md）

## 学习路线（图 fig01）
基础铺垫（01–04）→ 课题设计（05）→ 环境数据（06–07）→ 预处理注释（08–09）→ 生态位（10）→ 通讯（11–13）→ 写作（14–16）。

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## 第 00 章 导读与学习路线
- 这本书讲什么：一个完整的"空间生态位细胞通讯重编程"课题长什么样
- 学习路线图（fig01）、三周/六周进度表
- 前置要求与心态：不要求编程高手，要求耐心
- 如何使用本书：代码复现、图注对照、练习

## 第一部分 基础铺垫

### 第 01 章 肿瘤微环境与细胞通讯的生物学基础
- 肿瘤微环境（TME）组成：癌细胞、癌症相关成纤维细胞（CAF）、免疫细胞（T/B/NK/巨噬细胞/中性粒细胞）、血管与淋巴管内皮、细胞外基质（ECM）
- 细胞通讯的基本形式：自分泌/旁分泌/近分泌/内分泌；配体-受体互作
- 关键通讯通路举例：趋化因子（CXCL12-CXCR4）、免疫检查点（PD-L1-PD-1、CD86-CTLA4）、生长因子（TGF-β、VEGF）、ECM 互作（胶原-整合素）
- 肿瘤如何"重编程"微环境：免疫抑制、血管生成、EMT、代谢重编程
- 图：fig04（TME 组成）、fig05（配体-受体示意）
- 小结与思考题

### 第 02 章 空间转录组技术原理：从单细胞到 10x Visium
- 单细胞测序的成就与盲区：丢失空间位置
- 空间转录组技术谱系：原位测序（ISS/seqFISH/MERFISH）、原位捕获（Visium/Slide-seq/HD）、成像（CODEX/MIBI）简要对比
- 10x Visium 原理详解：6.5×6.5 mm 捕获区、约 5000 spot、spot 直径 55 μm、中心距 100 μm、poly-A 捕获（FF 与 FFPE 探针法差异）
- Visium 数据结构：barcodes/features/matrix、spatial 图像与坐标、h5 文件
- 空间转录组的局限：spot 是多细胞混合（去卷积必要性）、分辨率、dropout
- 图：fig02（sc vs 空间）、fig03（Visium 原理）
- 小结与思考题

### 第 03 章 生信入门必备：R/Python 与数据结构
- R 基础：向量、数据框、tibble、管道 `|>`、ggplot2 绘图理念
- Python 基础：numpy 数组、pandas DataFrame、AnnData（X/obs/var/obsm/uns）
- Seurat 对象结构（RNA assay、meta.data、reductions）与 SingleCellExperiment
- 常用文件格式：10x mtx 三件套、h5、h5ad、rds、CSV
- 简单数据操作练习（20 分钟上手）
- 图：fig07 部分（用 R 画第一张图）
- 小结与练习

### 第 04 章 空间生态位与通讯推断方法学总览
- 核心概念：空间生态位（niche）/空间域（domain）/邻域（neighborhood）的定义与区别
- 生态位识别方法谱系：空间聚类（BayesSpace、SpaGCN、STAGATE、Squidpy 聚类）、邻域富集（Squidpy nhood enrichment / co-occurrence）、隐变量方法（Misty、STIE）
- 通讯推断方法谱系：无空间约束（CellChat、NicheNet、CellPhoneDB）、空间感知（COMMOT、CellChat v2 空间模式、Giotto）
- 方法选择决策树："生态位×通讯重编程"课题推荐组合：BayesSpace/Squidpy 定生态位 + CellChat v2 分区通讯 + COMMOT 空间活性 + Squidpy 共定位验证
- 图：fig06（生态位概念）、fig11（邻域富集示例）
- 小结与思考题

## 第二部分 课题设计

### 第 05 章 课题设计：创新点拆解与实验路线
- 一句话课题：比较肿瘤组织不同空间生态位（肿瘤核心/侵袭前沿/免疫浸润区/基质区）的细胞通讯网络，揭示微环境"通讯重编程"
- 创新点拆解：① 生态位视角替代全局视角 ② 通讯"重编程"（生态位间差异）而非单点通讯 ③ 空间共定位证据增强
- 研究假设（可证伪）：H1 不同生态位通讯网络显著不同；H2 侵袭前沿存在免疫抑制性通讯重编程；H3 通讯差异与临床意义（可选预后）
- 分析路线图（fig01 详版）：数据 → QC → 聚类注释 → 生态位 → 分区通讯 → 差异 → 验证 → 写作
- 预期图表清单（对应 fig08–fig17）
- 小结与练习：写自己的课题一句话

## 第三部分 实战全流程

### 第 06 章 环境搭建与工具链
- conda/mamba 管理：创建空间转录组环境
- R 环境：R 4.3+、RStudio、关键包（Seurat v5、CellChat v2、BayesSpace、tidyverse）
- Python 环境：Python 3.10+、scanpy、squidpy、matplotlib、anndata
- 环境导出 yaml + 复现
- 常见坑：Seurat v5 与 v4 差异、CellChat 依赖（NMF、ComplexHeatmap）、Windows 下 Rtools
- 代码：code/01_setup.R、envs/spatial-niche.yaml
- 小结与练习

### 第 07 章 数据获取：Visium 公开数据集
- 数据集选型：为什么用 10x Visium 人乳腺癌 demo（肿瘤结构典型、官网可下载）＋ 结直肠癌（可选）
- 10x 官网下载流程（barcodes/features/matrix + spatial 目录 + H&E 图像）；GEO/Spatial 数据仓库（如 spatialLIBD、Zenodo）备选
- 数据清单与校验（data-inventory）
- 下载脚本：code/02_download.R（含 URL 与 md5）
- 图：fig07 顶部（数据总览表示意）
- 小结与练习

### 第 08 章 预处理与质控
- QC 指标：每个 spot 的 UMI 数、基因数、线粒体比例（RNA）、空 spot 判别
- 过滤阈值设定：基于分布（violin/直方图）而非拍脑袋
- 归一化：Seurat LogNormalize / SCTransform 对比；scanpy normalize_total+log1p
- 高变基因、PCA、UMAP/t-SNE、聚类（Louvain/Leiden）
- 空间可视化入门：SpatialDimPlot / squidpy.pl.spatial_scatter
- 图：fig07（QC violin + 空间）、fig08（UMAP + 空间聚类）
- 代码：code/03_preprocess.R
- 小结与练习

### 第 09 章 降维聚类与细胞类型注释
- 为什么要注释：spot 是混合信号
- 策略 A：marker 基因直接注释（经验打分）
- 策略 B：单细胞参考去卷积：cell2location（Python）/ RCTD / SPOTlight；讲解原理与实操
- 策略 C：与公共单细胞图谱整合注释（如乳腺癌图谱）
- 结果解读：细胞类型空间分布、占比堆叠条形图
- 图：fig09（注释空间图 + 构成）
- 代码：code/04_annotation.R（含 cell2location 调用说明）
- 小结与练习

### 第 10 章 空间生态位识别
- 生态位识别三步：① 空间域分割（BayesSpace/SpaGCN/STAGATE 实操）② 邻域富集验证（Squidpy nhood enrichment）③ 生态位命名与特征化（marker/通路）
- BayesSpace 实操：preprocess → spatialCluster → 选择 q（聚类数）
- Squidpy nhood enrichment：细胞类型共定位 → 识别"生态位组成"
- 生态位命名规则：肿瘤核心（高肿瘤 marker、低免疫）、侵袭前沿（EMT marker、肿瘤-基质交界）、免疫浸润区（高免疫）、基质区（CAF/ECM）
- 生态位特征基因与通路（如 Hallmark）
- 图：fig10（生态位空间图）、fig11（邻域富集热图）
- 代码：code/05_spatial_domain.R
- 小结与练习

### 第 11 章 细胞通讯分析基础：CellChat
- CellChat 原理：CellChatDB 配体-受体库、通讯概率（质量作用定律）、显著性检验（排列检验）、通讯网络聚合（通路级）
- CellChat v2 空间模式：cell groups 模式与 cell-spot 模式
- 实操：构建 CellChat 对象（从 Seurat）→ identifyOverExpressedGenes → computeCommunProb → computeCommunProbPathway → aggregateNet
- 经典可视化：气泡图（netVisual_bubble）、网络图（netVisual_circle/heatmap）、山脊图
- 图：fig12（通讯网络）、fig13（通讯数量强度）
- 代码：code/06_cellchat.R
- 小结与练习

### 第 12 章 生态位内通讯：分区 CellChat 分析
- 核心思路：按生态位 split 数据 → 每个生态位独立建 CellChat → 比较"生态位特异的通讯程序"
- 实操：subset 各生态位 spots → 各自运行 CellChat → 汇总
- 生态位内通讯特征：免疫浸润区的 T-B 互作、侵袭前沿的肿瘤-CAF 互作
- 生态位内 vs 全局通讯的差异（为什么全局分析会"平均掉"空间异质性）——对应创新点
- 图：fig12（分生态位网络并列）、fig13（分生态位柱状）
- 代码：code/07_niche_cellchat.R
- 小结与练习

### 第 13 章 通讯重编程：生态位间差异通讯分析
- "重编程"的操作化定义：生态位间通讯网络/通路的系统性差异（数量、强度、方向）
- 差异通讯分析：compareInteractions、netVisual_diff、rankNet 对比；CellChat 跨条件差异（subset 后 compare 的流程）
- 差异信号通路识别：如侵袭前沿高活性：TGF-β、CXCL、MIF、GALECTIN；免疫抑制：PD-L1/PD-1 仅在特定生态位出现
- 空间活性验证：COMMOT 空间活性图、Squidpy 共定位佐证（配体细胞-受体细胞相邻）
- 重编程信号流的"故事化"呈现：Sankey/河流图（fig16）
- 图：fig14（差异通讯）、fig15（通路活性热图）、fig16（重编程信号流）
- 代码：code/08_differential_comm.R
- 小结与练习

### 第 14 章 图表规范与综合可视化
- 论文级图表规范：字号、配色（色盲友好）、坐标、图注、分辨率（300 dpi）
- 关键图表制作清单（对应 fig08–fig17）：空间散点、气泡图、网络图、热图、堆叠条形、Sankey
- 一图一故事：如何编排结果图（Figure 1 路线图 → Figure 2 生态位 → Figure 3 通讯差异 → Figure 4 重编程通路）
- 图：fig17（论文图版式示例）
- 代码：code/09_visualization.R
- 小结与练习

## 第四部分 写作与进阶

### 第 15 章 结果解读与论文写作
- 如何讲"重编程"故事：从现象（生态位组成差异）→ 机制（通讯差异）→ 意义（临床/免疫治疗）
- 结果章节结构：四段式（生态位识别、生态位特征、通讯差异、重编程通路）
- 图表-文字对应；数字一致性检查
- 投稿期刊建议：空间组学方向（Nat Commun、Genome Medicine、Cancer Cell 子刊等）
- 预印本（bioRxiv）流程
- 小结

### 第 16 章 常见问题与排错
- 安装类：Rtools、BiocManager、CellChat 依赖、Python 版本冲突
- 运行类：内存不足（Visium 数据量）、Seurat v5 语法差异、cell2location 训练不收敛
- 可视化类：中文乱码（matplotlib/ggplot2 字体设置）、图像对齐、PDF 字体
- 结果类：聚类不稳定、注释不准、通讯推断假阳性（为什么需要空间验证）
- 检查清单（交付前逐项打勾）
- 小结

## 附录
- 附录 A 术语表（中英对照，约 60 词条）
- 附录 B 资源与参考文献（工具官网、教程、论文清单 → references.bib）
- 附录 C 示例数据与代码清单（每个 R 脚本的用途与运行顺序）

## 配套脚本（code/）
| 脚本 | 章节 | 内容 |
| --- | --- | --- |
| 01_setup.R | 06 | 环境与包安装 |
| 02_download.R | 07 | 下载 Visium 数据 |
| 03_preprocess.R | 08 | 预处理与 QC |
| 04_annotation.R | 09 | 细胞类型注释 |
| 05_spatial_domain.R | 10 | 生态位识别（BayesSpace + Squidpy） |
| 06_cellchat.R | 11 | CellChat 基础分析 |
| 07_niche_cellchat.R | 12 | 生态位分区通讯 |
| 08_differential_comm.R | 13 | 差异通讯/重编程 |
| 09_visualization.R | 14 | 论文级图表 |
| 10_summary.R | 15 | 汇总输出与报告 |

## 教学图（figures/，17 张）
fig01_roadmap / fig02_sc_vs_spatial / fig03_visium_principle / fig04_tme_composition / fig05_ligand_receptor / fig06_niche_concept / fig07_qc / fig08_clustering / fig09_celltype / fig10_niche / fig11_nhood / fig12_comm_network / fig13_comm_barplot / fig14_diff_comm / fig15_pathway_heatmap / fig16_reprogramming / fig17_paper_figure

## 假设登记（科研循环）
- H1：不同空间生态位的细胞通讯网络存在系统性差异（数量/强度/通路）
- H2：侵袭前沿生态位存在免疫抑制性通讯重编程（如 PD-L1/PD-1、TGF-β 高活性）
- H3：生态位分区通讯分析相比全局通讯分析能揭示更多空间异质性信号
